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Bajas dosis de etopósido-tratamiento induce la muerte celular endoreplication y acompañada de alteraciones del citoesqueleto en las células A549: ¿La respuesta implica la senescencia? El posible papel de la vimentina Abstracto Fondo Senescencia en la población de células a menudo se describe como un programa de capacidad de proliferación restringida, que se manifiesta por amplios cambios morfológicos y bioquímicos, incluyendo un cambio metabólico hacia una respuesta similar a la autofagia y una inducción de estrés genotóxico relacionados poliploide. Al mismo tiempo, se cree que está detenido irreversiblemente la progresión del ciclo celular de una célula senescente. Los informes recientes sugieren que este fenómeno puede tener una influencia en el resultado terapéutico del tratamiento contra el cáncer. El objetivo de este estudio fue verificar la posible implicación de este programa en la respuesta al tratamiento de la población de células A549 con dosis bajas de etopósido, así como para describir acompaña alteraciones del citoesqueleto. métodos Después del tratamiento con etopósido, seleccionado los parámetros bioquímicos y morfológicos fueron examinados, incluyendo: la actividad de la senescencia asociado a ß-galactosidasa, la formación SAHF, progresión del ciclo celular, la inducción de p21 Cip1 / Waf1 / SDI1 y ciclina D1, roturas de la cadena de ADN, la disrupción de la membrana celular asimetría / integridad y alteraciones ultraestructurales. Vimentina y el citoesqueleto de actina G se evaluó tanto citometría y microscópicamente. Resultados y conclusiones Etopósido indujo un fenotipo similar a la senescencia en la población de células A549. Las alteraciones morfológicas, sin embargo, no se acoplan directamente con otros marcadores de senescencia, incluyendo una detención del ciclo celular estable, la formación SAHF o p21 inducción Cip1 / Waf1 / SDI1. En su lugar, una fracción poliploide, TUNEL-positiva de células creció de forma visible en número. También se observó la regulación positiva de la ciclina D1. Aquí presentamos evidencia preliminar, sobre la base de los análisis microscópicos, que sugieren un posible papel de vimentina en alteraciones nucleares que acompañan a los eventos polyploidization-depolyploidization siguientes lesiones genotóxicas. Palabras clave fenotipo de senescencia-como etopósido Poliploidía Depolyploidization vimentina G-actina Fondo El etopósido es un derivado semisintético de la podofilotoxina procedentes de Podophyllum peltatum o emodi Podophyllum [1]. Este compuesto actúa sobre la topoisomerasa II, una enzima implicada en el procesamiento de DNA durante su replicación, transcripción y recombinación. A la escisión reversible de una o ambas de ADN se encuentra por la enzima es crucial para la modulación de su topología, es decir, estructura superhelical, así como para la de enredo de la molécula [2]. El etopósido afecta enzima ADN complejos escindibles, mediante la estabilización de ellos, y por lo tanto la inhibición de la capacidad de la topoisomerasa para ligar estas discontinuidades [3]. La interacción de estas estructuras con las horquillas de replicación, complejos de transcripción u otras enzimas de ADN de procesamiento puede finalmente dar como resultado la formación de irreversibles roturas de la cadena de ADN [4]. Este modo de acción es conocido por estar relacionado con el mayor efecto quimioterapéutico del agente, es decir, de células la inducción de muerte. Sin embargo, también ha habido algunas sugerencias de que la respuesta de las células cancerosas al etopósido también involucra a otros mecanismos, tales como aberraciones cromosómicas, aneuploidía y endoreplication [5. 6]. La importancia de estos fenómenos todavía no se ha determinado completamente y se encuentra actualmente en discusión en relación con la catástrofe mitótica, senescencia, neosis y la supervivencia celular. El objetivo de este trabajo es evaluar la influencia del tratamiento con bajas dosis de etopósido en la línea celular A549 en el contexto de algunos cambios en el citoesqueleto relacionados con la inducción de la muerte celular / senescencia. La línea celular A549, que fue nuestro modelo experimental, se ha clasificado como un carcinoma de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma y fue derivada previamente de neumocitos de tipo II [7]. Como este tipo de cáncer de pulmón es una de las principales causas de muerte a nivel mundial, la línea se utiliza con frecuencia en los estudios que investigan los efectos de diferentes drogas. Sin embargo, antes de la interpretación de los resultados obtenidos, es fundamental tener en cuenta los antecedentes genéticos de la línea, es decir, deleciones homocigóticas de Ink4a p16, p14 y p15 Arf INK4B [8 - 11]. Los productos de estos genes influyen en el resultado de la quimioterapia, debido a su participación en la supresión de tumores a través de la muerte celular detención del ciclo celular / irreversible. Por lo tanto, parece importante para evaluar tanto la posibilidad y la extensión de la inducción de estos diferentes procesos en células A549. Algunos de los componentes del citoesqueleto han sido previamente demostrado ser útiles como indicadores de la célula bienestar, y se han descrito como marcadores indicativos de fenómenos particulares [12 - 15]. En este trabajo, nos gustaría hacer referencia a alteraciones seleccionadas en la organización, así como el nivel de proteínas del citoesqueleto, especialmente G-actina y vimentina, definidos como posibles marcadores de senescencia celular, con el fin de realizar un análisis más a fondo de las características de la respuesta celular a etopósido. resultados características morfológicas y bioquímicas de la muerte senescencia / célula - parámetros seleccionados La influencia de etopósido en células A549 se evalúa en función de la manifestación de determinados eventos relacionados con la muerte senescencia y / o celular en la población de células, incluyendo SA actividad ß-galactosidasa, la senescencia asociada a heterocromatina focos (SAHF) formación, p21 / Cip1 Waf1 / SDI1 y ciclina D1 de inducción, la velocidad de fragmentación de ADN, así como el porcentaje de células con la externalización de fosfatidilserina y / o interrupciones en la membrana celular. Se puede comprender mejor fue adquirida en electrónica de transmisión observaciones microscópicas de la ultraestructura celular y citometría de flujo formulario de análisis de la distribución del ciclo celular. El rango de dosis utilizadas en la parte inicial de este estudio fue la siguiente: 0,5; 0,75; 1; 1,5; 2; 3; 6 micras. Todas estas concentraciones indujeron un aumento estadísticamente significativo en el porcentaje medio de células que presentan una actividad mejorada de SA ß-galactosidasa en comparación con la muestra de control (estadísticas Cochran-Cox; P0.05), es decir, 0,75, 1,5 y 3 etopósido M. Actividad de la senescencia asociada a la ß-galactosidasa en células A549 después del tratamiento con etopósido - datos estadísticos de los exámenes microscópicos de luz. La incubación con concentraciones crecientes de la droga (0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3 y 6 M etopósido) para 72 h fue seguida de otras 24 h de incubación en medio fresco. Se detectó la actividad de la enzima a pH 6. Diferencias muy altamente estadísticamente significativas en comparación con las células de control están marcados con un asterisco (estadísticas de Cochran-Cox, P0.001). Los resultados son representativos de diez experimentos independientes. Todas las concentraciones de etopósido utilizados en este estudio (0,75, 1,5, 3 M) indujo una disminución estadísticamente significativa en el porcentaje de células A549 con el contenido de ADN correspondiente a G 0 / G 1 y S en comparación con las células de control (Mann-Whitney estadísticas U) (Figura 2). Al mismo tiempo, hubo aumentos estadísticamente significativos en la población de células respectivas a G 2 / M fases y contenidos de ADN superiores (G 2) (Figura 2). Un análisis biparamétrica de la tasa de fragmentación de ADN en relación a su contenido, lo que resulta del método de TUNEL, reveló que la fracción más dañado significativamente estaba representado por las células en G 2 / M y, en particular, con contenido de ADN más altas, lo cual era evidente en 1,5 y 3 etopósido mu M (Figura 3). a-e la distribución del ciclo celular de las células A549 después del tratamiento con etopósido - datos estadísticos de los análisis de citometría de flujo (tinción con RNasa / PI). a células con contenido de ADN típicos de G 0 / G 1 fases del ciclo celular, las células B con contenido de ADN típico de la fase S, las células c con contenido de ADN típicos de G 2 / M fases, las células D con contenido de ADN típicos de subG 1 fracción, las células e con el contenido de ADN típico de poliploidía. Las diferencias estadísticamente significativas en comparación con las células de control están marcados con un asterisco (estadística de Mann-Whitney U, P0,05). Columnas - porcentaje medio de células, bares - rango intercuartil. Los resultados son representativos de cinco experimentos independientes. tasa de fragmentación de ADN en relación con el contenido de ADN en las células A549 después del tratamiento con etopósido - representativos punto-parcelas de los análisis de citometría de flujo (el método TUNEL); superior izquierda - las células de control, parte superior derecha - 0,75 M etopósido, abajo a la izquierda - 1,5 M etopósido, abajo a la derecha - 3 M etopósido. La dosis más alta del medicamento (3 M) fue más eficaz en la inducción de roturas de cadena de ADN, que estaban presentes en más de 50% de la población celular (Figura 4). No fueron estadísticamente aumentos significativos en el número de células dUTP-FITC-incorporan incluso después del tratamiento con la más baja de las concentraciones aplicadas (0,75 M) (Figura 5). Por otro lado, subG 1 fracción, correspondiente a las células con contenido de ADN inferior a la típica de G 0 / G 1. se aumentó visiblemente sólo en las células expuestas a 1,5 y 3 etopósido mu M (Figura 2 D). En cuanto a la anexina V / ensayo de PI, los resultados obtenidos fueron similares a TUNEL indicaciones, que muestran aumentos estadísticamente significativos en el porcentaje de células que manifiestan características de apoptosis temprana y tardía, así como necrosis después del tratamiento con todas las concentraciones de etopósido utilizados en el estudio, como se en comparación con la población de células sin tratar. Al mismo tiempo, la población de células con integridad conservado y la asimetría de las membranas estaba en la disminución (Figura 6). A la dosis más alta de etopósido, que resultó ser más eficaz en la inducción de la muerte celular, se obtuvieron los siguientes valores de la mediana: 2,6% para las células la anexina V-positivo / PI-negativas (características de apoptosis temprana), 6,2% para anexina V / células PI-positivos (características de finales de apoptosis / necrosis) y 19% para las células la anexina V-negativa / PI-positivo (fenotipo necrótico). tasa de fragmentación de ADN en las células A549 después del tratamiento con etopósido - histogramas representativos de citometría de flujo análisis (el método TUNEL); superior izquierda - las células de control, parte superior derecha - 0,75 M etopósido, abajo a la izquierda - 1,5 M etopósido, abajo a la derecha - 3 M etopósido. tasa de fragmentación del ADN en las células A549 después del tratamiento con etopósido - datos estadísticos de análisis de citometría de flujo (el método TUNEL). Las diferencias estadísticamente significativas en comparación con las células de control están marcados con un asterisco (estadística de Mann-Whitney U, P0,05). Columnas - porcentaje medio de células, bares - rango intercuartil. Los resultados son representativos de cinco experimentos independientes. a-d viabilidad celular en la población de células A549 después del tratamiento con etopósido - datos estadísticos de los análisis de citometría de flujo (el ensayo de anexina V / PI). Las células que presentan características de una apoptosis temprana (anexina V + / PI), b apoptosis tardía (anexina V / PI), c necrosis (V - anexina / PI +) y D células viables (anexina V - / PI-). Las diferencias estadísticamente significativas en comparación con las células de control están marcados con un asterisco (estadística de Mann-Whitney U, P0,05). Columnas - porcentaje medio de células, bares - rango intercuartil. Los resultados son representativos de cinco experimentos independientes. Estos cambios bioquímicos también fueron acompañadas por alteraciones ultraestructurales que progresan gradualmente con concentraciones crecientes. Había algunas células alargadas, en las que no sólo citoplasmática, sino también compartimientos nucleares fueron afectados visiblemente. La heterogeneidad del citoplasma se manifestó en la aparición de estructuras granulares densos en electrones, incluyendo los componentes de vacuolas como mielina similares, y de electrones clara (Figura 7). Algunas de ellas muy probablemente contenían materiales residuales, mientras que otros se parecían autofagosomas. Entre otros orgánulos, abundantes mitocondrias hinchadas, así como unos pocos dilatada cisternas del retículo endoplásmico estaban presentes. cambios morfológicos visibles también estaban relacionados con el área de núcleo, y que incluyen un aumento de tamaño, condensaciones de la cromatina, / núcleos lobulados segmentados, así como células multinucleadas. Además de esto, se pueden observar algunos signos más pronunciados típicos de la muerte celular, especialmente en la concentración aplicada más alto, incluso muy condensada, la cromatina densamente poblado, extensa vacuolización citoplasmática, y la pérdida de las formas fácilmente reconocibles de orgánulos, lo que sugiere la apoptosis tardía o necrosis secundaria ( la Figura 7 e, f). Algunas células que representan manifestaciones de daños agudos, con degenerar citoplasma, pueden responder directamente por la ejecución de la necrosis (Figura 7 f). Sin embargo, una subpoblación de células no mostró diferencias significativas morfológicos en comparación con el grupo control, que posiblemente representa clones resistentes a la quimioterapia de las células A549. A-F Los cambios morfológicos y ultraestructurales en células A549 después del tratamiento con etopósido - examen microscópico de electrones. unas células de control (7 x 000), B 0,75 M etopósido (5 x 000), c. d 1,5 M etopósido (4 x 000), e. f 3 M etopósido (6 x 000). alteraciones progresivas de la zona núcleo y el citoplasma son evidentes. En la concentración más alta algunas células muestran características de extensa lisis / demolición del contenido celular, incluyendo estructuras de la cromatina como dispersos que aparecen en el citoplasma. Los resultados son representativos de cinco experimentos independientes. p21 Cip1 / Waf1 / SDI1 inmunolocalización mostró ni la inducción significativa de la expresión de esta proteína ni cambios evidentes en su localización subcelular en la mayoría de las células A549 de etopósido-expuesta (Figura 8). A diferencia de estos resultados, las alteraciones de la localización y la abundancia de la ciclina D1 fueron más evidentes (Figura 9). Como resultado del tratamiento, algunas células aparecieron con un aumento de la intensidad global de la tinción intranuclear para esta proteína. Además de eso, a las concentraciones más altas de etopósido (1,5 y 3 M), la señal de fluorescencia fue a menudo secuestrado en forma de focos, especialmente en el área nucleolar presuntiva (Figura 9 e, f). a-d inmunolocalización de p21 Cip1 / Waf1 / SDI1 en células A549 después del tratamiento con etopósido - examen microscópico de fluorescencia (p21 Cip1 / Waf1 / SDI1 marcaje indirecto, anticuerpo secundario fue de cabra anti-IgG de ratón-Alexa Fluor 488®). Las células de control a, b 0,75 M etopósido, c 1,5 M etopósido, d 3 M etopósido. Los núcleos se contratiñeron con DAPI. Los resultados son indicativos de tres experimentos independientes. Bar 50 micras. a-f inmunolocalización de ciclina D1 en células A549 después del tratamiento con etopósido - examen microscópico de fluorescencia (ciclina D1 marcaje indirecto, el anticuerpo secundario fue de cabra anti-IgG de ratón-Alexa Fluor 488®). Las células de control a, b 0,75 M etopósido, c 1,5 M etopósido, d. e. f 3 M etopósido. señal de fluorescencia mejorada de las celdas seleccionadas y ciclina D1 indica agregaciones (flechas, puntas de flecha). Los núcleos se contratiñeron con DAPI. Los resultados son indicativos de tres experimentos independientes. Bar 50 micras. La cuantificación de SAHF y otras anomalías nucleares reveló que el tratamiento indujo cambios profundos en la morfología nuclear, especialmente la aparición masiva de las células con núcleos grandes (Figura 10 a-e). Aunque la formación SAHF fue inducida por etopósido, el porcentaje de células que presentan estas estructuras se mantuvo a un bajo nivel estable independientemente de la concentración aplicada, que van desde 0,45 hasta 3,99% después del tratamiento (Figura 10 e). Al mismo tiempo, las células con manifestación SAFH revelaron ni p21 Cip1 / Waf1 / SDI1 ni ciclina D1 inducción (Figura 11 a-f). a-e progresivos cambios en la morfología de los núcleos en células A549 después del tratamiento con etopósido - datos estadísticos de la evaluación microscópica (tinción con DAPI). un Las células con núcleos regulares, células B con núcleos de un tamaño regular y con algunas anormalidades morfológicas (lobulación, invaginaciones, brotes), células c con núcleos indicativos de la apoptosis (cuerpos apoptóticos), células D con grandes núcleos, células e con características de SAHF formación. Las diferencias estadísticamente significativas en comparación con las células de control están marcados con un asterisco (estadística de Mann-Whitney U, P0,05). Columnas - porcentaje medio de células, bares - rango intercuartil. Los resultados son representativos de cinco experimentos independientes. a-f p21 Cip1 / Waf1 / SDI1 y ciclina D1 se dispersan en las células con SAHF - examen microscópico de fluorescencia (tinción como se describe anteriormente). a - c 0,75 M etopósido, d-f 3 M etopósido; a . d DAPI, b p21 etiquetado Cip1 / Waf1 / SDI1, etiquetado e D1 de ciclina, c. f fusionó. barra superior 25 micras, 10 micras barra inferior. componentes del citoesqueleto seleccionados - vimentina y actina G Análisis de citometría para el porcentaje de células vimentina-positiva indicó que no hubo cambios estadísticamente significativos en este parámetro resultante del tratamiento. La mediana de los valores oscilaron entre 82-86% para todas las concentraciones estudiadas y de las células de control, lo que nos permitió excluir la posibilidad de que algunas fluctuaciones en la intensidad de fluorescencia podrían haber sido causados por una distribución desigual de anticuerpos (figura 12 a). Por el contrario, la media de intensidad de fluorescencia, lo que refleja el nivel intracelular media de vimentina se aumentó, lo que sugiere que el etopósido actuó estimulante sobre esta proteína en las células A549, en comparación con la población de control (Figura 12 b). La tendencia de estas alteraciones no fue homogénea, como un aumento inicial en 0,75 y 1,5 M concentraciones fue seguido por menor, pero todavía valores estadísticamente significativamente altos de 3 M etopósido. a-b Cantidad de proteína vimentina en la población A549 después del tratamiento con etopósido - datos estadísticos de análisis de citometría de flujo. Porcentaje de células vimentina-positivas, la intensidad de fluorescencia b refleja el contenido vimentina. Estadísticamente no se observaron diferencias significativas en comparación con las células control (estadísticas de Mann-Whitney U, P0,05). Columnas - porcentaje medio de células vimentina-positivas, bares - rango intercuartil. Los resultados son representativos de cinco experimentos independientes. observaciones microscópicas de fluorescencia de filamentos de vimentina reveló algunas características únicas de su organización después de que el tratamiento de células A549 con etopósido. Un bien desarrollado, andamio regular de filamentos sutiles, delgadas y cortas era característica de la población de control no tratada. En estas células, los filamentos de vimentina forman una red citoplasmática uniformemente distribuida con más focos visibles situado en la zona perinuclear (Figuras 13 A y 14 a). Etopósido no sólo inducida por alteraciones en la forma y tamaño de las células, pero también una heterogeneidad en la forma y la organización citoplásmica de los filamentos intermedios de vimentina (Figuras 13. 14. 15). A partir de la concentración más baja (0,75 M etopósido), apareció algunas células agrandadas que presentan las fibras de vimentina gruesas o sus agregados en la región perinuclear, a lo largo del eje principal de la célula, sino también una distribución más uniforme en el citoplasma (Figuras 13 b, c , 14 d, f, 15 a, c). estructuras análogas eran visibles en las células expuestas a 1,5 M etopósido, y contó con una señal fluorescente de mayor intensidad (Figuras 13 d-fy 14 g, i). Sin embargo, en la bien desarrollada red de filamentos de vimentina, algunos espacios tejidas con menos regularidad aparecieron, en el que podrían estar situados orgánulos citoplasmáticos y otras inclusiones. Las poblaciones de células multinucleadas / grandes parecían estar aumentado en número. En estos, vimentina era abundante y formó estructuras en forma de anillo, especialmente alrededor del núcleo (Figuras 13. 14 y 15). Una señal fluorescente débil, dispersa y desapareciendo a nivel local era indicativo de células con degeneración citoesqueleto, en el que el ADN se sometió a la fragmentación o lisis, especialmente a las 3 M etopósido (Figuras 13 i, 14 j, l y 15 d, f). A esta concentración, una heterogeneidad morfológica visible ocurrió también. Aparte de las células grandes con redes bien desarrolladas de filamentos de vimentina, se observaron algunas células multinucleadas que presentan fluorescencia perinuclear intensa, así como otros que poseen señales más dispersas que reflejan estructuras vimentina más amorfas y la falta de un andamio de filamento regular (figuras 13 gi, 14 j, l y 15 d, f). Lo más probable, esto se relaciona con la fragmentación de los filamentos resultantes en el colapso del citoesqueleto alrededor del núcleo. Un hecho interesante pena destacar es que después de la exposición de las células A549 a etopósido, vimentina fue abundantemente presente en las invaginaciones de núcleos multi-lobulada, y especialmente en la región central del espacio intra-nuclear entre múltiples núcleos en células multinucleadas. Además, se observó solamente unas pocas células que ofrecen condensaciones de cromatina que se asemejan a los focos de heterocromatina senescencia similares. Estas células muestran andamios de filamentos más bien sutiles y regularmente tejidas, carentes de la presencia de estructuras de agregación similares en el espacio perinuclear (Figura 15). a-i Organización de vimentina en células A549 después del tratamiento con etopósido - examen microscópico de fluorescencia (vimentina marcaje indirecto, el anticuerpo secundario fue de cabra anti-IgG de ratón-TRITC). Las células de control a, b. c 0,75 M etopósido, d-f 1,5 M etopósido, g-i 3 M etopósido. Aparte de paquetes organizadas regularmente de filamentos en las células de control, abundante, sino estructuras más heterogénea organizados aparecieron como resultado del tratamiento. flechas gruesas indican en paquetes vimentina densas y gruesas en forma de agregados a modo de diafragma entre núcleos hermanas, especialmente comunes en las células multinucleadas, o hilos de vimentina en las invaginaciones nucleares; flechas gruesas dobles - estructuras en ciernes-como putativo en las proximidades de las células de los padres; - flechas delgadas largas colas vimentina; puntas de flecha - difusas manchas vimentina en torno a núcleos con características de cariorrexis o cariolisis. Los núcleos se contratiñeron con DAPI. Los resultados son indicativos de cinco experimentos independientes. Bar 50 micras. a-l Organización de vimentina en células A549 después del tratamiento con etopósido - examen microscópico de fluorescencia (vimentina marcaje indirecto, anticuerpo secundario fue de cabra anti-IgG de ratón-BODIPY). A-C Control de las células, d-f 0,75 M etopósido, g-i 1.5 M etopósido, j-l 3 M etopósido; a . d. g. etiquetado vimentina j, b. e. h. k DAPI, c. f. yo . l se fusionó. La tinción con este método nos permite visualizar en un gran detalle sutiles hilos de filamentos de vimentina ubicados en las invaginaciones de núcleos. Aparte de paquetes organizadas regularmente de filamentos en las células de control, abundante, sino estructuras más heterogénea organizados aparecieron como resultado del tratamiento. flechas gruesas indican en hilos delgados en las invaginaciones nucleares o haces de vimentina más densas en forma de agregados de diafragma entre núcleos hermana, especialmente común en células multinucleadas; flechas gruesas dobles - células que presentan largas colas vimentina tinción (vimentina), núcleos hermanas cercanos el uno o hilos finos de la cromatina que conectan estrechamente con sede núcleos hermana (DAPI); puntas de flecha - difusas manchas vimentina en torno a núcleos con características de cariorrexis o cariolisis. Los resultados son indicativos de cinco experimentos independientes. Bar 50 micras. a-f Organización de vimentina en células A549 después del tratamiento con etopósido - examen microscópico de fluorescencia (vimentina marcaje indirecto, anticuerpo secundario fue de cabra anti-IgG de ratón-BODIPY). a-c 0,75 M etopósido, d-f 3 M etopósido; a . d etiquetado vimentina, b. e DAPI, c. f fusionó. Las fotografías seleccionadas que presentan núcleos raros con estructuras de la cromatina que llevan semejanza con focos de heterocromatina asociada a la senescencia (flechas finas). Estas células destacados ya sea desaparecer (a. C) o más regularidad tejida (d. F) vimentina andamio, desprovistos de hilos / focos típico de invaginaciones nucleares y / o células multinucleadas. flechas gruesas indican en estructuras a modo de diafragma entre núcleos hermana (a. c), los agregados vimentina en el área perinuclear de células / células multinucleadas que poseen núcleos forma anormal (d. f) o núcleos de estas células (b. e). flechas gruesas dobles putativos - estructuras en ciernes similar (un c.); puntas de flecha - difusas manchas vimentina en torno a núcleos con características de cariorrexis o cariolisis (d f.). Los resultados son indicativos de cinco experimentos independientes. Bar 50 micras. Ambos métodos empleados para el análisis-actina G (es decir, con DNasa I y VDBP) sugirieron una localización más bien uniforme de este componente en las células de control A549 en comparación con la población de etopósido-expuesta, en la que más intensa tinción era característica de la región perinucear de la célula (Figuras 16 y 17). Estas alteraciones eran especialmente evidente en las células que poseen grandes núcleos segmentados o en células multinucleadas resultantes del tratamiento (Figuras 16 b-d y 17 b-d). Los focos perinuclear fueron similares a las estructuras de vimentina en forma de anillo, pero organizados con menos regularidad. Algunos agregados, más probable es que reflejan el proceso de nucleación de filamentos de actina, se encuentran en la parte central y corticales del citoplasma. Otras estructuras detectadas a través de etiquetado DNasa I, sugieren ya sea un aumento del número de vesículas G-actina-positivas, que pueden haber sido formados durante una extensa degradación exocitosis / ADN en respuesta a etopósido, o puede simplemente resultar de DNasa I afinidad para algunos de los componentes mitocondriales, en cuyo caso se reflejan la formación inducida por estrés oxidativo de estos orgánulos (Figura 16). Sin embargo, se observó fluorescencia más intensa en las células que presentan un fenotipo de muerte celular se define por la presencia de núcleos picnóticos o fragmentados, con independencia del método de tinción empleado (Figuras 16 C, D y 17 c, d). a-d localización de G-actina en las células A549 después del tratamiento con etopósido - examen microscópico de fluorescencia (etiquetado con DNasa I). Las células de control a, b 0,75 M etopósido, c 1,5 M etopósido, d 3 M etopósido. agregación visible de G-actina en la zona perinuclear después del tratamiento, así como un aumento del número de las estructuras de actina G-positivo punteado y vesículas como en el citoplasma. Los patrones de fluorescencia intensos indicativos de células con fragmentación del ADN. Los núcleos se contratiñeron con DAPI. Los resultados son indicativos de cinco experimentos independientes. Bar 50 micras. a-d localización de G-actina en las células A549 después del tratamiento con etopósido - examen microscópico de fluorescencia (etiquetado con VDBP). Las células de control a, b 0,75 M etopósido, c 1,5 M etopósido, d 3 M etopósido. agregación visible de G-actina en la zona perinuclear después del tratamiento, así como en forma de estructuras de puntos como en el citoplasma. Los patrones de fluorescencia intensos indicativos de células con fragmentación del ADN. Los núcleos se contratiñeron con DAPI. Los resultados son indicativos de cinco experimentos independientes. Bar 50 micras. Un contenido de G-actina relativa en el núcleo de la célula se estimó después del tratamiento con etopósido, en comparación con la población de células sin tratar. Estadísticamente no se observaron diferencias significativas, solamente algunas pequeñas fluctuaciones en la intensidad de fluorescencia de la actina G aparecieron como resultado del tratamiento. la intensidad de fluorescencia G-actina en células de control negativo también fue estable (datos no mostrados). Estas indicaciones fueron apoyados además por examen microscópico confocal preliminar. Discusión La senescencia en el nivel celular se cree que es un programa de detención del ciclo celular irreversible, en que la célula se mantiene que no responde a la estimulación mitogénica. Sin embargo, la actividad metabólica de la célula se mantiene, lo que resulta en la aparición de algunas manifestaciones morfológicas que se pueden definir como un fenotipo de células senescentes, e incluyen la ampliación acompañado por el aplanamiento de la célula, una mayor actividad de la senescencia asociado a ß-galactosidasa, la acumulación de lipofuscina , así como una mayor granularidad citoplásmica y el volumen nuclear. Algunas alteraciones relacionadas adicionales al núcleo y sus funciones comprenden la formación de SAHF y, sobre todo, los cambios en el patrón de expresión de genes supresores de tumores, por ejemplo p53. p21 Cip1 / Waf1 / SDI1. p14 Arf. Ink4a p16. pRb [16-19]. Sin embargo, sobre la base de los resultados obtenidos en el presente estudio, así como nuestro informe anterior [20] y aportes obtenidos de los experimentos de los demás, se sugiere que debe haber una clara distinción entre la senescencia a nivel celular y la senescencia de la toda la población de células, por ejemplo modelos de línea celular. Las primeras observaciones con respecto a estos fenómenos provienen de los estudios de Hayflick, que presentaron una capacidad de proliferación restringida de las poblaciones celulares in vitro [21]. Más tarde, se demostró que las características analógicas de existir en líneas celulares de cáncer como resultado de un tratamiento quimioterapéutico y otras modalidades terapéuticas [22 - 24], aunque estas células eran considerados previamente a ser "inmortal" debido a la proliferación sin restricciones y la expresión de la telomerasa. Por otra parte, recientemente el impacto clínico del programa de senescencia, así como los pros y los contras de su inducción se han discutido ampliamente [25 - 28]. Al mismo tiempo, la falta de una definición clara y marcadores inequívocos indicativa de este fenómeno, hace que sea especialmente difícil de establecer firmemente su contribución al resultado final de la terapia. Tanto más porque algunas características se perciben erróneamente como determinantes cruciales del programa. Estas características podrían incluir la actividad ß-galactosidasa asociada a la senescencia y la inducción poliploide mejorada. En cuanto a la inducción de poliploidía, se ha documentado que la población de células de someterse a la senescencia replicativa puede presentar un punto de control mitótico defectuoso, que finalmente conduce a mitosis aberrantes [29]. En vista de estos resultados, no se puede descartar que algunas alteraciones nucleares poliploidía acompañan reflejan un evento de crisis similares, incluyendo algunos ciclos de rotura-fusión-puente que se traducen en un aumento de la inestabilidad genómica. En nuestra investigación, una población G2 / M fue aumentando de forma paralela a la inducción poliploide, que puede evocar más bien una respuesta endoreplication-como después de un deslizamiento mitótico. Al mismo tiempo, la extensión de G 2 / M células así como las células que contiene la acumulación de SAHF parecía ser relativamente baja en comparación con los que se manifiesta mejorada SA ß-galactosidasa, un hecho que puede, junto con polyploidization, sugerir una senescencia inestable como el programa inducida por etopósido. También resultados del método TUNEL implican una acumulación de células de G 0 / G 1 y S fases del ciclo celular en G 2 / M y transitorios detención seguido por algunos eventos de muerte endoreplication / célula. Debido al hecho de que extensa fragmentación del ADN acompañado estas alteraciones, los ciclos de la inestabilidad cromosómica y la rotura-fusión-puente no pueden ser excluidos. Se obtuvieron resultados similares por Sliwinska et al. (2009) después del tratamiento de las células HCT116 con doxorrubicina, otro inhibidor de la topoisomerasa II. Los autores afirmaron que una fracción sustancial de las células se sometió a endocycling sin entrar en mitosis, y que algunas células poliploides divisorias producen progenie aneuploid [30]. la señalización de daño en el ADN se ha demostrado para ser acoplado a su replicación en respuesta directa a inhibidores de la topoisomerasa, incluyendo etopósido en la población de células A549. Por un lado se sugiere la inducción de DSB después de la colisión de los complejos escindibles con las horquillas de replicación, pero algunos DSB también apareció en las células no replicantes, que pueden ser indicativos de otros mecanismos de acción de este fármaco, es decir, la generación de estrés oxidativo o colisión de conclusiones métodos Análisis del ciclo celular inmunofluorescencia análisis estadístico Los autores declaran que no tienen intereses en competencia. referencias PubMed Cancer Res. PubMed Naturaleza. Cancer Res. Celda. Cancer Res. PubMed Cancer Res. PubMed Celda. Cancer Res. PubMed Cancer Res. Naturaleza. Ver artículo PubMed Genes Dev. Naturaleza. Ann N Y Acad Sci. Más uno. Cancer Res. PubMed Cancer Res. Ver artículo Naturaleza. Am J Pathol. Más uno. PubMed PubMed Celda. Biochem Biophys Res Commun. Derechos de autor BioMed Central 2013
