La cloroquina 83

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E FECTO DE C EN T HLOROQUINE RANSDUCTION DE C ELL L INES Y ABOON B CD34 C ELLS POR UN GALV P SEUDOTYPED R ETROVIRUS Kamran Alimoghaddam MD Hematología, oncología y trasplante de médula ósea Research Center, Universidad de Teherán de Ciencias Médicas, Teherán, Irán Antecedentes - cloroquina es una amina que inhibe las enzimas lisosómicas y se utiliza cada vez para aumentar la tasa de transfección de las células durante la transferencia de genes. Sus efectos sobre la transferencia de genes mediada por retrovirus (transducción) no son claramente evidentes. Aquí, se estudiaron los efectos de este fármaco sobre la eficacia de transducción en una variedad de líneas celulares y en células hematopoyéticas. Métodos - Se utilizó un pseudotyped retrovirus GALV (PG13 / MNDEGFPSN) para la transducción de las líneas celulares Hela, 208F, K562 y HL60, y babuino columna-talón seleccionados células CD34 + utilizando diferentes métodos, y en presencia de diferentes concentraciones de cloroquina. Transducción se mide por detección de células que producen fluorescencia verde en un citómetro de flujo. Resultados - La cloroquina (100 mol (28,76 ± 2,12%) de la cloroquina). En otros experimentos, la cloroquina aumentó positividad PI de las células de babuino y la disminución de la eficacia de transducción (19,09 ± 0,61% y 17,99 ± 0,22% sin cloroquina en experimentos segundo y tercero, respectivamente). Conclusión - Aunque la cloroquina inhibe la eficacia de transducción en las líneas celulares, que tenía el efecto opuesto en babuino células CD34 + y de hecho puede aumento de la transducción de estas células. Palabras clave células madre • Correspondencia: K. Alimoghaddam MD, Hematología y Oncología y Centro de Investigación de BMT, Shariati Hospital, Kargar Ave, Teherán 4114, Irán. E-mail: alimogh@sina. tums. ac. ir. La cloroquina es una amina que se utiliza ampliamente para aumentar la transfección de genes en las células. 1 Es una base débil con diferentes efectos sobre la fisiología celular 2 y la entrada de virus de ARN con envoltura en las células. Como una base débil, entra rápidamente las células en cuestión de segundos, acumulando dentro de las partes ácidas de la célula (incluyendo lisosomas y endosomas). A causa de esta acumulación en el interior de las células, algunas vacuolas aparecen. La acumulación de esta base débil dentro de las células conduce a la inhibición de las enzimas lisosomales que requieren un pH ácido ( 4-5) y también evita la fusión de los endosomas y lisosomas, evitando así la degradación de las proteínas ingeridas y materiales extraños relacionados. 2-4 La cloroquina también ejerce efectos tóxicos sobre las células que están relacionadas linealmente con la concentración del fármaco y la duración de la exposición. También evita la síntesis de proteína celular y se degrada ciertas enzimas celulares. 3-5 La entrada de los virus de ARN con envoltura (incluyendo retrovirus) en las células puede ser dependiente del pH o pH - independiente. Para la entrada viral dependiente del pH, el virus se une a los receptores en la superficie de la célula y es envuelto dentro de un endosoma. Después de la reducción del endosoma, los cambios Conforma-tional se producen en el receptor viral. Esto es seguido por la fusión de la superficie de envoltura y endosomal, ayudando a la entrada de la partícula de virión en el citosol. Las aminas y otras sustancias que impiden la acidificación del endosoma prevenir tanto la salida del virus original y la entrada de una nueva partícula viral. 6 - 9 Tabla 1. Toxicidad de diferentes concentraciones de cloroquina durante 48 horas de cultivo de células de 50.000 células / pocillo y la exposición a la droga. Los valores son la media de la célula viva en cada uno de los pozos; ND = no realizado; 0 = todas las células murieron. Para la entrada viral independiente del pH, no se requiere la inducción de cambios conformacionales en el receptor del virus. El virus entra en la célula directamente desde la superficie celular, sin necesidad de inmersión endosomal, o entra en la célula por lo que rápidamente después de inmersión que cualquier cambio de pH asociados son innecesarios. Aminas (cloruro de amonio, Aman-tadine y cloroquina) no pueden evitar la entrada de estos virus en las células. 10,11 La mayoría de los retrovirus de mamíferos utilizan un mecanismo independiente del pH, 10, pero algunos, como ecotrópica murina de Moloney retrovirus, entrar en la mayoría de las células en forma de partículas dependientes del pH. Sin embargo, en ciertas líneas celulares, que entra a través de un mecanismo independiente del pH. 10 El mecanismo de entrada es depende-ent tanto en el virus y del tipo celular. En la mayoría de los estudios, la cloroquina ha sido utilizado como un inhibidor de virus de entrada una herramienta para determinar el mecanismo de la entrada del virus. En algunos estudios, se utilizó con éxito para aumentar la transducción de vectores basados ​​en retrovirus. Por lo tanto, muchos investigadores llegaron a la conclusión de que la cloroquina aumenta la eficacia de transducción por la prevención de la digestión lisosomal de retrovirus dentro de las células, rescatando así algunas de las partículas virales, lo que aumenta la eficacia de transducción. 12 La cloroquina tiene otros efectos en las células, que incluyen la inhibición de la síntesis de proteasas, fosfolipasas y los esteroides, la síntesis de ADN basal y alteración de la fluidez de la membrana. Además, se une a la superficie celular y fosfolípidos de la membrana, 4 y es tóxico para los varios tipos de células. En este estudio, se estudió el efecto de la cloroquina sobre la transducción y la toxicidad asociada de células CD34 babuino y una variedad de líneas celulares. Materiales y métodos Para estudiar los efectos de la cloroquina sobre la transducción retroviral de líneas de células, se eligieron tres líneas celulares: células HeLa, D17 y 208 células F. Se seleccionaron líneas celulares K562 y HL60 y células hematopoyéticas BM babuino seleccionado CD34 sin preestimulación in vivo para estudiar los efectos de la cloroquina sobre la transducción de las células hematopoyéticas. Para el cultivo de Hela, D17 y 208F células, transferimos 50.000 células / pocillo, a placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos tratadas en presencia de DMEM que contenía 10% de suero de alta bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina, 24 horas antes trans-ducción. Para el cultivo de las células K562 y HL60, transferimos 50.000 células / pocillo de 12 pocillos placas de cultivo de tejido tratado en la presencia de 2 ml de RPMI que contiene 10% HIFBS y 1% penici-LLIN / estreptomicina y 50 ng / ml de G-CSF en algunos de los pozos para acelerar la proliferación celular. Se utilizó la línea celular de empaquetamiento PG13 contiene un pseudotyped GALV (mono gibón virus de la leucemia) MNDEGFPSN vector (HP Kiem Lab, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, EE. UU.) para estudiar la expresión de la GFP (proteína verde fluorescente), 48 horas después de transducción. Para la producción de vector después de la transferencia de platos 5,5 x 10 06 al 15 cm, en días 3 y después de subconfluency de los cultivos celulares, se cambió el medio con un mínimo de medio aplicable (15 ml), y el vector se cosechó, 12 horas más tarde, para un total de tres veces. Después de filtrar, las preparaciones de vector fueron transferidos a un congelador a -70 ° y se utilizan dentro de los 2 meses después de la cosecha. La multiplicidad de infección (MOI) de estas cosechas fue de aproximadamente 3. Tabla 2. Toxicidad para las células, determinada por tinción de propidio. G-CSF = granulocyt factor estimulante de colonias. transducciones línea celular se realizaron en presencia de 8 mg / ml de sulfato de protamina con diferentes concentraciones de cloroquina (50 mol - 100 mu mol). Tiempo de exposición al fármaco varió de aproximadamente 6 a 12 horas. Después de la transducción, el medio se cambió después de lavar los pocillos con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y las células se realimentaron con DMEM o RPMI. Cuarenta y ocho horas después de la transducción, la expresión de GFP fue leído por una máquina activado flujo clasificador de células (FACS). En algunas de las muestras, se añadió cloroquina 3 horas después del inicio de la transducción para la discriminación entre la toxicidad o el bloque de entrada, y algunas células Hela también se transdujeron en presencia o ausencia de cloroquina a pH 5,8, para estudiar los efectos de los cambios de pH en la transducción. Preparamos DMEM pH 5,0 por la adición de HCl, y después se añadió 1 ml de medio ácido a un subconjunto de los pocillos que estaban sin tratar o tratado previamente con cloroquina durante 15 minutos. Después de la adición de un volumen igual de vector que contiene normal de pH DMEM, el pH final alcanzó 5,8. Después de la exposición de las células a estas condiciones, el medio se cambió por la adición de DMEM fresco pH normal. Repetimos los estudios de transducción de líneas de células tres veces para cada línea celular, y cada estudio se repitió al menos una vez. Todos los valores obtenidos se muestran como la media de las eficacias de transducción (los resultados duplicados de la gama en cada experiencia estuvo cerca). Sin embargo, nosotros no estamos reportando resultados de toda la gama de la simplicidad de la presentación de informes. Tabla 3. Eficiencia de transducción de líneas celulares. Para el estudio de la toxicidad celular, 50.000 células / pocillo de células 208F y Hela se transfirieron a placas de 6 pocillos y después de 24 horas de transferencia que cambió a medio que contenía cloroquina (50 y 100 m mol). Las células se expusieron a esta concentración de el fármaco durante 6 - 24 horas. Después de 48 horas y después de tripsinización de las células y de exclusión de azul tryptan, se contaron las células y se compararon con el número de células en los pocillos no tratados. Además, en el análisis FACS, las células teñidas con yoduro de propidum para excluir las células con lesiones graves en el estudio. Transducción de babuino CD34 + células Tabla 4. Efectos de la adición de cloroquina, 3 horas después del inicio de la transducción. Después de recibir las células frescas CD34 médula ósea +, que fueron ordenados por un procedimiento del lecho de la columna, las células se transfirieron (50.000 células / pocillo) a 12 pocillos placas de cultivo no tejido, que se recubrieron con fragmento de fibronectina recombinante (CH-296, 2 mg / cm 2). Las células fueron preestimuladas durante 24 horas con un cóctel de crecimiento de megacariocitos y factor de desarrollo (MGDF) (50 ng / ml), factor de células madre humano (50 ng / ml), interleucina-6 (50 ng / ml) y FLT-3 ligando (50 ng / ml). Tales concentraciones se mantuvieron durante la transducción y los resultados se registraron. 24 horas después de la preestimulación, se transdujeron las células, una vez o cuatro veces, cada 12 horas, en presencia de 8 m g / ml de sulfato de protamina. 13 Entre 50 y 100 m mol cloroquina se usó durante la última transducción (para pozos transducidas individuales durante la transducción). Los resultados se registraron para la expresión de GFP, 7 días después de comenzar la pre estimulación. Tabla 5. activados-Flow de clasificación de células en los resultados días después de la transducción de células Hela con cloroquina añadirse en el inicio de la transducción, o 3 horas más tarde. 6 horas transducción 12 horas transducción resultados de transducción fueron leídos por análisis FACS, después de la tripsinización y la tinción de las células con 2 m g / ml PI para isotiocianato de fluoresceína (FITC) y PI, y se analizaron los datos después de la exclusión de células muertas. El número de células estudiadas contados al menos 10.000 en cada lectura. Los resultados del estudio de toxicidad por exclusión de azul tryptan de células Hela y 208F células se muestran en la Tabla 1. Para las células de babuino CD34 +, en un experimento con buena eficacia de transducción, sin toxicidad cloroquina asociado apareció, probablemente debido a la toxicidad de la cloroquina es dependiente de la concentración y dependiente del tiempo de exposición, y cada uno es diferente para diferentes tipos de células. Además, la cloroquina causado algunos cambios en la forma de las células, lo que llevó hacia adelante y dispersión lateral durante el análisis FACS, que es más evidente en concentraciones más altas de la droga. toxicidad cloroquina a las células también se estudió mediante la comparación del porcentaje de células PI-positivo en el momento de análisis FACS (Tabla 2). Por lo tanto, parece que aunque la cloroquina es tóxico para las líneas de células hematopoyéticas a concentraciones superiores a 50 m mol, es tolerable en estas líneas celulares a concentraciones más bajas. La eficacia de transducción de líneas celulares Varias líneas de células diferentes se eligieron para la transducción de entender los mecanismos de acción de la cloroquina. Las eficacias de transducción diferían en diferentes líneas celulares en respuesta a diferentes concentraciones de cloroquina y diferentes tiempos de exposición a la droga (Tabla 3). Está claro que la reducción de la cloroquina asociado en la eficacia de transducción fue proporcional al tiempo de exposición a la droga. Para estudiar más a este efecto, se añadió a las células cloroquina 3 horas después de la transducción. La posterior adición de la transducción de la eficiencia mejorada de medicamentos, pero no corregir por completo (Tabla 4). La pregunta sigue siendo, es el efecto de la cloroquina debido a la toxicidad del fármaco sobre la expresión génica (que afecta a la síntesis de proteínas en las células) o afecta a la entrada del virus en la célula, o la replicación viral (transcripción inversa) y la integración de la ¿vector? Para responder a esta pregunta, las células transducidas se cultivaron durante 4 días (en vez de los 2 días) antes de leer los resultados de FACS para eliminar la toxicidad temporal a las células. En este experimento, se usó otro subcultivo de las células HeLa, en el que la eficacia de transducción fue menor que en los experimentos descritos anteriormente (Tabla 5). Además, las células HeLa se transdujeron con pH 5,8 medio de crecimiento, en presencia o ausencia de cloroquina añadido antes de la transducción, para discriminar entre el bloque de entrada vector pH inducida de otros posibles efectos (Tabla 6). El cambio en el pH tuvo ningún efecto sobre la eficacia de transducción en estas condiciones. Transducción de babuino CD34 + células células CD34 + babuino tolerados diferentes concentraciones de cloroquina durante menos de 12 horas de exposición, pero períodos más largos causadas todas las células a morir. La eficacia de transducción varió en diferentes experimentos (Tabla 7) y, aunque, la cloroquina aumento de la transducción en un experimento, no aumentó en otro. En estos experimentos, transduced CD34 de médula ósea babuino seleccionado columna-+ células cuatro veces. Las eficiencias de transducción sin cloroquina fueron similares en tres experimentos y aunque, la adición de 50 mol m cloroquina no tuvo efectos importantes en el segundo y tercer experimentos, el aumento de la eficacia de transducción en el primer experimento. Del mismo modo, la cloroquina en 100 m mol reduce la eficacia de transducción en el segundo y tercer experimentos y aumentó en la primera. Por lo tanto, se concluyó que la cloroquina en 50 m mol no tuvo ningún efecto negativo en la transducción de células CD34 + de babuino. En el segundo experimento, las células CD34 + se transdujeron por una exposición al vector solamente, con y sin la cloroquina. La cloroquina a 50 m mol tuvo un pequeño efecto negativo en la eficiencia de transducción (11,74 ± 0,8 sin cloroquina vs 7,08 ± 0,6 a 50 m cloroquina mol). La concentración de cloroquina más alto (100 m mol) impidió la transducción profundamente (1,31 ± 0,5). Tabla 6. Efecto del cambio de pH (por 6 horas) en la eficiencia de transducción de las células HeLa. FSC = Forescatter, SSC = dispersión lateral. Las diferentes respuestas a la cloroquina observados durante nuestros experimentos con babuinos células CD34 + pueden deberse a diferentes proporciones de células Lin-positivo (76,8% en la muestra 1, 24,71% en la muestra 2; indeterminado para la muestra 3) y células CD34 + (92,13% en la muestra 1, 94,63% en la muestra 2 y 79,64% en la muestra 3). Además, la proporción de células grandes maduras (de acuerdo con forescatter y carácter-Ristic de las células dispersión lateral) en estos tres experments diferían después de 7 días de cultivo (15,38%, 12,93% y 27,85% en las muestras 1 - 3, respectivamente). ¿Cuáles son los efectos biológicos exactos de cloroquina durante la transducción de células con vectores retrovirales? De acuerdo con nuestro estudio, parece que la cloroquina afecta a la transducción de las células en la fase inicial de la transducción más bien que en la última fase, probablemente antes de la integración del virus, porque incluso después de cultivar las células durante un largo periodo de tiempo para evitar los efectos tóxicos de el fármaco en las células transducidas y su progenie, hubo una reducción en la eficiencia de transducción. Además, parece que este efecto está relacionado con el tiempo de exposición a la droga y de su concentración. Parece que sus efectos inhibidores de la droga en la transducción relacionadas con sus iniciales en los primeros pasos de la entrada del virus a las células, antes de la integración del virus. Aunque el pH-dependencia o independencia del virus en la entrada no se demostró, y la inhibición de la transducción no se resuelven con adición tardía de la cloroquina por lo que estos pasos son últimos eventos en la biología de la integración del genoma retroviral. En otro experimento, no se describe aquí, cuando las células HeLa se transdujeron continuamente dos veces durante 12 horas y se añadieron 100 m mol de cloroquina en el segundo transducción, la eficacia de transducción se redujo a la mitad en comparación con el grupo de control no tratados con cloroquina en absoluto (43,1% vs 23,6%). Los efectos de la cloroquina en células CD34 + eran más complejas que otras líneas celulares. Esta complejidad puede haber sido debido a la heterogeneidad de las poblaciones de células o un proceso más complejo de la transducción de las células. Sabemos también que la cloroquina se extruye a partir de células por un gen múltiple proteína de resistencia a fármacos (MRP), por lo que puede ser posible que la concentración de este fármaco que se alcanza en el interior de las células CD34 + es mucho menor que otras líneas celulares. 14 Este estudio estuvo limitado por la proporción de células más maduras después de la transducción y también la cantidad de células CD34. Además, la cantidad de las células PI-positivas en estos tres estudios fue variable, y aumentó después de la exposición a la cloroquina. Aunque PI positividad en las células nontransduced varió entre las células, la respuesta de estas células a la cloroquina era opuesta a su respuesta a la transducción, por lo que cuando la cloroquina inducida PI positividad, se redujo la eficacia de transducción y viceversa. Por lo tanto, puede ser la concentración más baja de cloroquina o su uso en células de MRP-positivo que aumenta la transducción, por la inhibición de enzimas lisosómicas y la prevención de la destrucción intracelular de las partículas virales por estas enzimas. Erbacher P, Roche AC, Monsigny M, et al. papel putativo de la cloroquina en la transferencia de genes en líneas celulares de hepatoma humano por el ADN / polilisina lactosilado complejos. Exp Cell Res. 1996; 225 186 - de 94. Dean RT, Jessup W, Roberts CR. Efectos de la exógeno-usamines en células de mamíferos, con especial referencia al flujo de la membrana. Biochem J. 1984; 217: 27 - 40. De Duve C. Los lisosomas revisited. Eur J Biochem. 1983; 137 391 - 7. Myerowitz R, Robbins A, Proia RL, et al. Los estudios de la biosíntesis de la enzima lisosomal en las células cultivadas. Methods Enzymol. 1983; 96 729 - de 36. Seglen PO, Grinde B, Solheim AE. 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